南京理工大学研究团队提出一种新的计算三维显微成像技术：孔径编码光场显微成像

近日，南京理工大学电子工程与光电技术学院智能计算成像实验室(Smart Computational Imaging Laboratory, SCILab)研究团队在Laser & Photonics Reviews上发表题为“Programmable Aperture Light-Field Microscopy”的文章。蔡泽伟教授为文章的第一作者，陈钱教授与左超教授为共同通讯作者，南京理工大学为论文的唯一通讯单位。 　　

文章提出了一种新的计算三维显微成像技术：孔径编码光场显微成像(Programmable Aperture Light-Field Microscopy, PALFM)。该项工作发现通过对光学成像系统的光瞳进行环形调制可将其点扩散函数(PSF)调整为贝塞尔光束，并使PSF在轴向上延展，极大地拓展成像景深。传统断层扫描技术通常使用相干光源(例如平行光束和扇形光束)照射被观察物体，获得物体在特定方向的投影，并通过物体与光源的相对运动得到多个方向的投影进行三维重建，而在显微成像条件下通常难以精确操控样品与光源。在荧光成像中通常通过轴向扫描与层切特性实现三维重建，而通过断层扫描原理重建三维物体仍然是空白。文章提出通过贝塞尔PSF形成的二维图像相当于三维待测样品沿观测方向的投影，对应于三维傅里叶空间中的一个二维切片，研究团队将该特性称之为“非相干傅里叶切片定理”。根据该定理，改变环形孔径相对光轴的极角所得到的强度图对应于三维频谱中的不同角度的切片，揭示了利用环形孔径调制可以将计算断层扫描技术应用于非相干荧光宽场显微镜的三维成像中。文章进一步设计了一种由非中心对称的圆形和环形孔径组成的混合孔径调制方案，以实现更高的频谱覆盖率，并确保二维切片映射的完整性和唯一性。文章通过对小鼠肾脏切片进行三通道三维荧光成像，展示了PALFM技术可实现对复杂样品进行高质量三维成像。对海拉细胞(HeLa)动态三维成像结果也展示了PALFM技术在活细胞动态成像方面的广泛应用前景。 　　

光学显微镜是观察生物样品的精细结构和动态行为的强大工具。通常可以通过光与物质相互作用(如吸收、折射、散射和荧光辐射)表征成像过程并恢复三维结构。其中，荧光蛋白或染料作为探针标记样品的分子结构，已广泛应用于生物医学研究。荧光分子受激辐射的特异性和敏感性使这些成像模式具有三维成像和超分辨率成像功能。结构光照明显微镜(SIM)、受激辐射损耗显微镜(STED)、光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)等典型的荧光成像技术，可以通过操纵激发光实现点扩散函数调制或单分子定位，同时分辨率能够突破衍射极限。 　

传统计算断层扫描技术与PALFM技术对比

相比之下，传统的宽场荧光显微镜不具备光学切片能力，当被测样品较厚时，探测信号同时包含了聚焦和离焦荧光信号。物理或生物化学门控技术试图获得局部目标信号，然后进行全局扫描，以尽可能消除散焦杂散光的干扰。典型的成像技术有共焦显微镜、全内反射荧光显微镜、双光子/多光子显微镜、光片显微镜、和结构光照明显微镜。相反，轴向扫描和焦点扫描等技术不加区分地收集三维物体信息，并通过去卷积算法抑制离焦信号。然而，在机械运动或介质变形的情况下，扫描过程不可避免地伴随着运动惯性，需要一定的稳定时间，从而限制了成像速度。除此之外，可以通过多焦点成像和光场成像获得包含多焦点或空间角度信息的合成信号，并进一步解耦重建。这些空间复用技术可以实现单次体成像，但通常牺牲了空间分辨率。 　　

为了解决以上问题，研究团队提出了一种新的计算三维显微镜技术，称为可编程孔径光场显微(PALFM)，用于无运动、高分辨率体成像。文章发现使用环形孔径可以将成像系统的PSF调制为贝塞尔光束，使PSF在轴向上保持恒定，实现景深延拓的成像效果。并推导了非相干傅立叶切片定理，发现环形孔径下检测到的二维强度信号等于三维物体频谱中的一个二维切片，揭示了环形孔径调制可以将计算断层扫描(Computed tomography, CT)技术应用于非相干荧光宽场显微镜。 　　

传统CT技术通常使用相干光源(例如平行光束)来照射被观察物体以获得特定方向的投影，投影强度图是频谱的一个切片。光学衍射层析(Optical diffraction tomography, ODT)将衍射效应考虑在内，即投影从频谱内的一个切片拓展为球面。为了恢复完整的三维物体信息，通常需要借助于相干光源，待测物体和照明光束必须相对旋转以收集多方向投影，并且针对具有吸收或者散射特性的样品才能够进行三维反演。然而对于荧光样品成像而言，大部分基于轴向扫描与光切片原理重建三维物体，目前尚缺少从CT的角度对三维重建进行阐述的方法。针对以上问题，文章提出PALFM技术，采用孔径调制灵活改变成像系统的PSF来调控光束，无需借助于样品旋转或光束扫描的机械装置，以实现无运动、高分辨率体成像。 　　 　　 　　

根据非相干傅里叶切片定理，通过调制环形孔径可以获得不同法线方向的物频谱切片。具体来说，通过改变环形孔径的位置和尺寸绕光轴从不同角度旋转，使得反向投影的光谱频谱切片逐渐填满三维物体光频谱空间谱。研究团队综合考虑了频谱扩展和频率覆盖两个因素，设计了一种由不同直径和旋转角度的非中心对称环形和圆形孔径组成的混合孔径调制方案。并提出了一种混合孔径调制方案的迭代层析重建算法。环形孔径能够提供大景深范围与轴向层析能力，圆形孔径能够带来高效的频覆盖率，二者的相互结合使得高效、高分辨的PALFM体成像成为可能。 　　

研究团队所设计的混合孔径编码方案包含不同位置和直径围绕光轴均匀旋转的环形和圆形孔径，可以从图的动画中直观看到圆心位置以及直径发生变化时三维传递函数的变化。通过调控环形孔径圆心位置相对于光轴的极角，可以相应地改变频域切片的旋转角度。随着半径的增加， 3D-OTF的截止频率得到延展。通过将环形孔径改变为圆心，能够有效提高频域中相应角度切片的填充率，使得频谱填充效率更高。 　　

实验上，首先通过测量USAF分辨率板来验证PALFM的成像性能。使用20×/ 0.45NA物镜进行成像，全孔径的理论横向和轴向分辨率极限分别为724nm和5.27μm。分辨率板首先水平放置在焦平面上，使用环形和圆形孔径可以获得类似的结果。三维重建体渲染结果如图4a、b所示。在焦平面上，圆形孔径的重建结果可以区分分辨率板的10-4，大约相当于690nm的横向分辨率。相比之下，环形光圈的横向分辨率提高到615 nm(10-5)，而当离焦距离为1.4μm时，物体信息几乎无法区分。图4d将重建体积的最大强度投影(MIP)的相关数据和高斯拟合曲线绘制在z轴上，通过测量半高全宽，证实与环形和圆形孔径序列相关的轴向分辨率分别为约5μm和约1.3μm。接下来，通过显微镜的位移台将分辨率目标平移到不同的轴向位置。在每个位置，使用由非中心对称环形和圆形孔径组成的混合孔径调制方案进行三维体重建，同时使用圆形孔径的结果作为参考。图4e分别显示了10、50和70μm轴向位置处重建结果的放大局部视图。可以看出，混合孔径调制方案在40μm的深度范围内获得了870nm(10-2)横向分辨率和≈6μm轴向分辨率的近衍射极限成像性能。相比之下，当轴向位置超过10μm时，圆形孔径的空间分辨率迅速下降。环形孔径能够带来无歧义的深度映射，而圆形孔径在提高频谱覆盖率的同时也带来了深度映射的歧义性，因此轴向分辨率降低。 　　

文章进一步通过实验证明了使用混合孔径调制方案能够对生物样品进行高分辨率、多色、无机械运动的PALFM体成像。对小鼠肾脏切片连续用三种不同波长的光束激发，并使用40×/0.95NA物镜进行成像。PALFM凭借可编程孔径的灵活调制，适用于活细胞的长时程三维观测。实验制备了体外HeLa活细胞作为观察样品，并进行了荧光染色标记。通过PALFM在3小时内进行成像。