用于选择性背景噪声抑制的频域STED显微镜

       据《先进光子学》报道，浙江大学的研究人员近日提出了一种新的显微技术，可以选择性地抑制现有受激发射损耗 (STED) 显微镜技术中的背景噪声。该方法有效地避免了 STED 成像中传统噪声抑制方法的局限性。

       受激发射耗尽(STED)显微技术是由Stefan W. Hell和Jan Wichmann于1994年开发的，并于1999年由Hell和Thomas Klar实验证明，是一种用于纳米显微镜的超分辨率技术，其开发者并因此于 2014 年获得了诺贝尔化学奖。 尽管STED显微镜技术已经取得了长足的进步，并被广泛应用于实际研究中。但在200 到 300 nm 的纳米技术实际应用中，仍会产生对空间分辨率和图像质量具有负面影响的不良背景噪声。一般来说，这种噪声来自两个信号源：耗尽束的超高光剂量引起的再激发产生的荧光，以及抑制束耗尽不足引起的残留荧光。

       尽管目前已经开发了多种背景去噪方法，但它们在实际应用中也存在某些缺点，包括图像失真、长时间采集或引入散粒噪声等。

       现有的背景噪声去除方法可以分为三类：时域、空间域和相量域。

图：频域 STED 显微方法，可以选择性地抑制 STED 成像中的背景。

       因此，研究团队提出了一种称之为“双调制差”STED（dmdSTED）的方法，可以有选择性地抑制背景噪声。该方法的工作原理是将空间域信号分选道频域，以便将未耗尽的荧光和 STED 诱导的背景与所需的荧光信号分离开来。激发光束和耗尽光束分别加载不同的时域调制。由于dmdSTED避免了耗尽光束引起的再激发，因此可以选择波长更接近样品荧光发射光谱峰值的耗尽激光，从而降低了所需的耗尽强度。

       当前 dmdSTED 方法的空间分辨率为 λ/8，比容易产生散粒噪声的相角域方法的分辨率更高。研究人员表示从理论上讲，该方法可以避免由时域方法（例如时间门控）引起的潜在信号损耗。此外，dmdSTED 与脉冲或连续波兼容，并且不需要使用时间相关单光子计数的硬件。相比空间域方法，dmdSTED 的时间分辨率不受限制。因此，dmdSTED 在空间分辨率、信噪比和时间分辨率等方面获取综合精细的显微图像具有优势。

       据现代光学仪器国家重点实验室主任、该研究的资深作者刘旭介绍，频域方法有潜力集成到其他双光束点扫描技术中，比如激发态饱和显微镜、电荷状态耗尽显微镜和基态耗尽显微镜等。此外，该方法可以接受更多类型的样品，这些样品的光谱特性不同于 STED 成像中常用的荧光染料，比如激发光谱更宽的量子点。