可以对生物过程进行精密成像的新型高速双光子显微镜

       双光子显微镜(TPM)通过使研究人员能够以高分辨率观察活体组织中的复杂生物过程，彻底改变了生物学领域。与传统的荧光显微镜技术相比，TPM利用低能光子激发荧光分子进行观测，反过来，这使得它可以更深入地穿透组织，并确保荧光分子或荧光团不会被激发激光永久损坏。然而，有些生物过程非常的快，即使是最先进TPM也无法记录。限制TPM性能的设计参数之一是线扫描频率，以每秒帧数(FPS)为测量单位，这指的是激发激光沿一个方向（例如，水平扫描）扫过目标样品的速率。由于缓慢的扫描频率决定了激光可以在另一个方向上（垂直扫描）的扫描速度，因此它也会影响系统的总FPS，这两者共同决定了显微镜的时间分辨率和观察帧大小之间的平衡。为了解决这个问题，由中国和德国的研究人员组成的国际团队最近开发了一种具有前所未有的高线扫描频率的强大TPM装置，该显微系统旨在以高时间和空间分辨率对快速生物过程进行成像，这项研究成果已经发表在《Neurophotonics》期刊上。

通过结合两种激光扫描模式，研究人员开发了一种可用于以高帧率和空间分辨率观察极快的生物过程的多功能双光子显微镜系统。图片来源：Neurophotonics(2023). DOI：10.1117/1.NPh.10.2.025006

       该装置区别于传统TPM的关键因素之一是利用声光偏转器(AODs)来控制激发激光的扫描。AOD是一种特殊类型的晶体，其折射率可以通过声波精确控制。反过来，这又使我们能够根据需要重新定向激光束。更重要的是，与传统TPMs中使用的电流计相比，AODs能够实现更快的激光转向。因此，该团队使用二氧化碲 (TeO2) 晶体设计了一个具有超高声速的定制AOD，实现了高线扫描频率。利用这个AOD，激光可以在仅仅 2.5 微秒内扫描帧中的一条线，这对应于400 kHz的最大线扫描频率。同样，该团队利用AOD在另一个方向上实现了合理的慢速扫描频率。

       为了进一步提高显微镜的适应性，该团队增加了在必要时切换到基于电流计的激光扫描机制的选项。这允许以可接受的分辨率和速度扫描样品的大区域，这使得在切换到AOD扫描之前更容易定位到感兴趣的小区域。该团队利用新设计的TPM进行了几次概念验证实验。他们在转基因小鼠身上安装了颅窗，并用它们来观察神经元的形态和活动以及单个红细胞 (RBCs) 的运动。该系统利用适当的AOD配置和帧大小实现了高达10,000 FPS的帧速率。这足以精确测量钙在神经元树突中传播的速度，以及可视化血管内单个红细胞的轨迹。

      《Neurophotonics》期刊副主编、加州大学伯克利分校实验物理学的Na Ji博士对这些结果印象深刻，他说：“基于AOD的扫描显微镜系统在成像速度和性能方面有了显著的提高，其在体内脑内钙信号传播和血流测量中的应用证明了这一点。”展望未来，新的概念验证的TPM系统将使捕获快速生物过程成为可能，并可以显著提高我们对它们的理解。

       消息来源：https://phys.org/news/2023-05-high-speed-two-photon-microscope-precise-biological.html

       [1]Ruijie Li et al, Ten-kilohertz two-photon microscopy imaging of single-cell dendritic activity and hemodynamics in vivo, Neurophotonics (2023). DOI: 10.1117/1.NPh.10.2.025006