新型无标记彩色三阶混频成像技术

       众所周知，细胞和组织依靠红细胞 (RBC) 的循环来提供氧气，因此红细胞生理活动的监测对分析人体正常和病理活动期间的组织代谢非常重要。基于外源荧光探针的双光子显微技术是用来测量红细胞微循环和血氧饱和度的相关成像技术，正在被越来越多地用于脑科学和生理科学。但是，其具有以下局限性，一是像素时间在几十毫秒内，难以直接探测到红细胞；二是测量对象是血浆而不是红细胞，基于荧光的微循环测量依赖于血液标记或受到相对较弱的自发荧光的干扰；三是受离焦背景信号干扰，成像深度受限。

       为了解决这一问题，巴黎综合理工学院的Emmanuel Beaurepaire等人通过活体斑马鱼作为研究对象，开发了一种新型的彩色三阶混频（TSFG）显微技术。

图1 (a)彩色TSFG显微术中同步信号过程的能量图，基于两个激发光束的三阶组合。(b)测量斑马鱼红细胞在脱氧(虚线)和氧化(实线)状态下的线性吸收光谱。所指示的波长是在混合1045和1300 nm激发的情况下产生的波长，并且包含血红蛋白的Soret吸收带，从而能够进行光谱测量。

       高功率光学参量放大器 (OPA) 和 1.3 至 1.7 μm 范围内 MHz 重复率的光源为三光子 (3P) 激发深层组织显微镜提供了新途径。除此之外，这些新型激光技术还可以实现基于三次谐波（THG）的高效无标记成像。

       THG 是一种三阶多光子成像模式，可突出细胞和组织中的界面和光学异质性，在细胞发育和神经科学等领域有广泛应用。科学家通常将THG 显微镜与 3P 荧光显微镜结合，通过对比的方式进行深层组织成像。在小鼠和鱼脑的活体成像中，THG 主要显示血管、富含髓鞘的区域和颅骨界面。尽管迄今为止THG对比度主要用于结构成像和作为空间标志，但当频率ω、2ω或3ω与样品中的电子共振相匹配时，三阶非线性极化率χ(3)（3ω; ω, ω, ω）会发生改变，预计可以从这些变化中获得吸收体的某些化学特性，进行功能成像。THG 显微成像的光谱范围可能与探测非荧光物体的吸收特性相关。它可以提供与红细胞的特定对比，并以无标记的方式报告它们在体内的氧合状态。要想实现这种功能性成像方法，首先需要建立并表征来自红细胞的 THG 信号的波长依赖性。此外，需要一种高效的与显微镜兼容的光谱成像方案，用于流动红细胞的观测。

图2活体成年斑马鱼脑中的深层组织三阶混频（TSFG）显微成像。(a)深层组织三阶混频（TSFG）显微成像设置方案 (b)彩色三阶混频（TSFG）成像计算的XZ切片图，成像深度大于600 μm。(c)端脑和分段血管中的成像体积的三维渲染。

       研究团队设计了一种基于同时测量 THG 和三阶和频生成 (TSFG) 信号的光谱成像方案。他们将波长在1045 nm-1300 nm范围的两束飞秒脉冲激光的时空域重叠后，将激励下产生的三次谐波（THG）和三阶混频（TSFG）光信号定向传输到三个独立的探测器上实现同步探测，实现对运动物体(如活体红细胞)的比率成像。该团队研究了几种发射波长，包括血红蛋白的 Soret 吸收带。

       以上实验结果是基于分离的红细胞、斑马鱼胚胎和活的成年斑马鱼大脑成像实验中的电子共振。研究人员表示，他们的方法可用于测量体内氧合动力学，有望在医疗技术和未来生物学研究中提供广泛应用。