研究病毒感染细胞过程的三维追踪成像显微成像技术

为更好了解病毒突破呼吸道和肠道细胞保护层的过程，杜克大学的研究人员使用多模式显微镜捕捉到了病毒接近目标细胞时的实时视频片段。研究人员使用这种三维追踪成像显微成像技术（3D-TrIm），首次成功观察到了病毒-细胞相互作用早期阶段的现象，包括发生在毫秒尺度上的相互作用。

Kevin Welsher教授说，现有显微成像方法很难观察到感染开始前的关键时刻。其中一个原因是：病毒在细胞外的移动速度要比细胞内部快两到三个数量级；另外一个原因是病毒比目标细胞小数百倍，因此更难成像。

这种多模3d三维追踪成像显微成像仪器兼具实时成像、主动反馈、单粒子跟踪和细胞环境实时容积成像功能，有助于研究病毒感染细胞的初始时刻，这是此前单独使用任何一种仪器都无法实现的。下一步，研究人员希望能用这项技术对病毒进行实时观察，模拟最初感染发生的条件。

多模显微成像技术的本质是将两台显微镜合二为一。第一台显微镜用于锁定病毒，为了计算、更新病毒位置，显微镜以每秒数万次的速度在快速移动病毒的周围进行激光扫描；当病毒在细胞外移动时，显微镜载物台不断进行调整以聚焦病毒。病毒上附有荧光标签，以便进行跟踪。

在第一台显微镜跟踪病毒的同时，第二台显微镜对周围细胞进行成像，相当于使用谷歌地图为行驶中的汽车导航。类似于谷歌地图中显示一个人在环境中物理位置的方式，病毒的位置及其周围环境在3D-TrIm中实时显示，与谷歌地图的唯一不同在于3D-TrIm是以三维方式显示的。

团队使用3D-TrIm观察了3000余个病毒轨迹，并演示了3D-TrIm使用与超分辨率显微镜类似的方法进行实时定位的过程。3D-TrIm的“超时间分辨率”能够观察病毒轨迹并检测扩散区的变化。这也使得在纳米尺度上追踪结构特征成为可能。

研究人员还使用3D-TrIm在紧密排列的上皮细胞中对单个病毒进行了跟踪，以演示3D-TrIm如何将简单单层细胞培养中的单粒子跟踪，推广到更真实、类似组织的条件下。据研究小组所知，目前尚未有关于单个病毒在紧密排列的上皮层中快速扩散现象的报道。

目前，研究人员每次只能跟踪病毒几分钟，之后荧光标签的亮度就会变暗。研究员Jack Exell说：“目前我们所面临的最大挑战是，如何使病毒更‘亮’。”

为帮助3D-TrIm将细胞外、细胞表面动态与单个病毒的传染性相关联，研究人员开发了一种高效的信息采样方法，只对病毒周围高信息区域采样，延长了观测时间。

研究人员认为，这一方法有望用于泛冠状病毒的研究，以及任何纳米级物体在大体积内发生快速运动的系统，例如纳米级候选药物的传输等相关研究中。

此项研究发表于Nature Methods (www.doi.org/10.1038/s41592-022-01672-3)。