Nature Methods｜自动对焦技术实现宽场亚细胞分辨率

如今，图像收集过程具有自动化操作的趋势。尤其是在生物成像中，自动化可以帮助提高样本容量实现准确的可视化。自动对焦技术是自动化图像收集的一个例子，其用于在从脆弱的生物系统获取数据的整个过程中保持图像清晰度。目前，佛罗伦萨大学和格拉斯哥大学的研究人员将自动对焦方法应用于光片显微镜，对完整的小鼠大脑光学成像证明它可用于分析大型标本。并且，该技术不仅可以应用于光片显微镜，还可以应用于快速移动生物体的体内荧光成像或 3D 跟踪。

由于缺乏能够以高分辨率分析大量数据的仪器，目前对全脑结构的研究仅达到粗略、低分辨率的水平。另外，现有的方法结合了光片显微镜方法以及能够使生物组织透明的化学反应，无法在大于尺寸大于几百微米的样本中保持高分辨率。

该项目利用了显微镜入瞳分割图像实现相位检测快速自动对焦技术（RAPID）——一种与光片显微镜和其他宽视野模式兼容的新型自动对焦技术解决上述问题。该技术能够实时校正样品本身引入的离焦问题。

RAPID：适用于宽视场显微镜的自动对焦技术

RAPID技术最初是于 2017 年由佛罗伦萨大学研究人员攻克的。现在，佛罗伦萨大学、欧洲非线性光谱实验室 (LENS) 和意大利 CNR 研究委员会联合对其申请专利。专利内容涉及使用光楔将穿过显微镜入瞳的光分成两束；一方面监控来自每个光束的两副RAPID 图像的对齐，另一方面来自远离焦平面光源的离焦光成像导致两幅图像的横向运动。这种位移的大小与离焦量直接相关，因此可作为自动反馈的信息，从而快速校正离焦问题。

在实验中，RAPID技术被应用于完整小鼠大脑的光片显微镜成像并实现了亚细胞分辨率。因此，这种方法将高分辨率范围扩大到全脑范围从而方便了生物学研究。另外，RAPID 也被用来表征小胶质细胞，小胶质细胞是大脑中具有不同功能的一组细胞，其形状根据它们的作用而改变。用 RAPID 对小胶质细胞的分析揭示了不同大脑区域之间的功能差异，为有关该细胞群作用的研究铺平了道路。

最后，虽然这里的RAPID结合光片显微镜发使用，但这种自动对焦技术实际上适用于所有宽视野显微镜技术。并且，其是广泛通用的，与样本无关的技术，因此在神经科学以外的也具有多种潜在应用。