基于二维光学缺陷的三维显微测量方法

       美国国家标准与技术研究院 (NIST) 的研究人员设计了一种使传统显微镜能够在三个维度上精确测量样品上光点位置的校准方法。为了开发他们的方法，研究人员解决了一个几乎影响所有光学显微镜的问题—透镜像差—并利用像差的影响在超广角和深场中精确地跟踪 3D 中的单个发射器。

       研究人员利用固有的散光和散焦以及其他像差，将他们的概念扩展到六个自由度的运动测量，在成像衬底和复杂的微系统上三维定位多个发射器。

        校准方法依赖于对研究人员为了校准他们的显微镜沉积在平面硅晶片上的荧光粒子图像的分析。研究人员分析这些粒子的图像时发现，由于透镜像差，当显微镜沿垂直轴（即第三维）以特定增量上下移动时，图像显得不平衡，粒子的形状和位置似乎发生了变化。研究人员进一步发现，即使显微镜在横向平面仅移动几微米或在垂直平面移动几十纳米，透镜像差也会造成较大的图像失真。

       研究人员在他们的论文中说， “该分析使研究人员能够准确地模拟透镜像差如何随着垂直位置的变化而改变荧光粒子的外观和表观位置，”。通过将粒子变化的外观和表观位置校准到其垂直位置，使团队能够成功地使用显微镜测量三个维度的粒子位置。
 

荧光粒子的图像，从上到下是位于显微镜最佳焦点的垂直位置的上方、中心和下方（左图）。通过校准透镜像差对粒子图像的表观形状和位置的影响，可以使用普通光学显微镜准确测量三个空间维度的位置。在微小旋转齿轮上的跟踪并结合来自许多荧光粒子的信息可以测试新校准方法的结果，并且阐明复杂微系统三个维度上的运动（右）。由 NIST 提供。

        为了测试他们的方法，研究人员使用他们的显微镜对随机沉积在三维旋转的微型硅齿轮上的荧光粒子群进行成像。研究人员表明他们的模型准确地修正了透镜像差，使显微镜能够提供有关粒子完整的三维位置信息。

       研究人员通过扩展了他们的位置测量来捕获齿轮的整个运动范围并完成了从系统中提取空间信息。这些额外的测量突出了因系统制造的缺陷而不同的微系统部件之间纳米级间隙的后果。NIST 研究人员表明零件之间的纳米级间隙不仅会降低有意旋转的精度，还会导致齿轮无意中摆动、摇摆和弯曲—所有这些都会限制性能和可靠性。

       在精度方面，该校准方法在接近 100 Hz 的频率时实现了 25 nm 的轴向精度和 10 µm 的轴向范围，以及 1 nm 的横向精度和 250 µm 的横向范围。即使是通过光学工程进行校正后，现代显微镜中仍可能存在的微小像差，这些值也是正确的。

       除了使普通显微镜能够进行 3D 测量外，NIST 开发的校准方法还能使显微镜更准确地定位物体的位置。它提供了使用普通光学显微镜和简单的定位分析在六个自由度上精确地测量运动的能力。NIST 团队的方法也不需要重新设计显微镜。

       研究人员表示他们的研究突出了定位显微镜中像差效应的挑战，并将这一挑战重新定义为准确、精确、完整定位的机会。研究员Samuel Stavis说，“与常识相反，透镜像差限制了二个维度的准确性，而使三个维度上实现了准确性，”，“通过这种方式，我们的研究改变了光学显微镜图像维数的视角，并揭示了普通显微镜进行测量的潜力。”

       Stavis 说，透镜像差提供的信息补充了显微镜学家目前在进行 3D 测量中不易实现的方法。NIST 方法有扩大 3D 测量可用性的潜力。

       研究员 Craig Copeland说，显微镜实验室可以很容易实施这种新方法。除了已经存在或正在出现的荧光粒子或类似标准外，不需要额外的设备。Stavis说，“用户只需要一个标准样品来测量它们的效果，和需要一个校准来使用结果数据，”。

       该研究发表在《Nature Communications 》上( www.doi.org/10.1038/s41467-021-23419-y ) 。