【分析】当温度计遇到纸芯片：基于光热效应的基因定量检测以及在低成本疾病诊断方面的应用

近日，美国德克萨斯大学埃尔帕索分校（The University of Texas at El Paso, UTEP）的李秀军（XiuJun Li）团队报道了一种基于光热效应的基因定量检测方法，仅用温度计作为信号读取工具，利用纸芯片作为载体，实现了对传染病（肺结核）病原体DNA的快速、灵敏、低成本的检测。

       病原体感染经常造成疾病在全球范围内的传播，对健康造成重大威胁。肺结核（tuberculosis, TB），作为最致命的传染病之一，位居单一传染疾病致死率首位，每年死亡人数超过150多万。中国的估算结核病新发患者数为86.6万 (2018年)。肺结核是由病原体细菌——结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）——感染人体引起的，传统的肺结核诊断方法依赖于临床检测、痰涂片镜检、细菌分离和培养等，这些方法步骤繁琐、耗时较长。近年来，基于MTB的分子检测方法迅速发展，利用比色、电化学、荧光、化学发光等技术，通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等DNA扩增方法，实现了对MTB的DNA分子的快速、定量检测。然而，此类方法依赖于昂贵的分析检测仪器和专业技术人员，不利于结核病的即时检测（point-of-care testing，POCT），限制了其在欠发达地区的应用和推广。

       为解决以上问题，该团队研发了一种新型的光热生物传感器用于肺结核诊断，仅利用温度计和纸芯片，MTB的DNA分子可被定量检测，检测过程简单、低成本，且不依赖于其他传统分析仪器。该研究首先通过一步法修饰纸表面（图1），将DNA捕获探针（capture DNA probe）固定在纸芯片载体上；之后，通过三明治DNA杂交手段，目标物MTB的DNA和金纳米颗粒修饰的检测探针（gold nanoparticle (AuNP)-modified detector probe）也被有选择性地固定在纸芯片上；加入底物（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）后，金纳米颗粒作为催化剂参与TMB氧化反应，体系由无色变为蓝色；由于光热效应，产物ox-TMB在近红外激光（808 nm）的照射下产热，导致体系温度升高，进而将目标物DNA分子的信息转化为温度信号；仅依靠温度计作为信号读取器，MTB的DNA分子即可被定量检测。

图1. 基于光热效应和纸芯片的DNA检测原理示意图。

该工作进一步探究了不同反应条件对光热温度信号的影响，包括底物TMB和催化剂AuNPs的浓度、激光照射时间等。以TMB为例，实验发现（图2），温度信号受底物浓度影响。在其他条件固定的情况下，随着TMB的浓度增加，可见光（650 nm）和近红外区域的吸光度首先呈上升趋势，激光照射5 分钟后，温度升高了15.0 ℃，这是由于作为比色和光热探针的ox-TMB的产量随之增加；当TMB浓度继续增加（高于0.25 mg/mL），由于催化剂的量有限，产物ox-TMB的浓度趋于饱和，可见光和近红外吸光度、温度信号均保持稳定。因此，为达到最佳检测条件，底物TMB的浓度优化为0.25 mg/mL。依照类似的方法，其他反应条件也依次优化。

图2. 光热检测体系中底物TMB浓度的优化：（A）可见-近红外吸收光谱、（B）650 nm和810 nm处吸光度、（C）温度升高值随底物浓度的变化。

基于以上优化条件，该体系被应用于定量检测MTB的DNA分子。实验结果证明，随着目标物DNA浓度的增加，纸芯片载体由无色变为蓝色（图3(A)(a-b)）；同时，在近红外激光照射3分钟后，体系温度逐渐上升至ΔT~17.0 ℃。在浓度范围0.1-50 µM，温度上升值与DNA浓度呈对数增长趋势，检测限可达39 nM（即0.58 µg/mL），其灵敏度远高于已报道的比色检测结果（例如10 µg/mL），该检测过程仅依靠温度计，避免使用任何昂贵的分析仪器。此外，利用染色溶液作为血液样品的替代（图3(A)(c)），实验结果显示，常规比色法易受着色样品的颜色干扰，而光热检测方法基于温度的变化，不受其干扰。而且，通过测试不同种类的病原体DNA，例如TB knockout DNA、M.smegmatis、DNA mixture (M. smegmatis 和TB knockout)、M. marinum等，此检测体系表现出了较好的特异性，可以区分高度相似的分枝杆菌（MTB和M. marinum）。该研究为病原体DNA检测提供了一种快速（检测时长2 h）、灵敏、低成本（单个纸芯片成本低至$0.08）、且不依赖于昂贵分析仪器的新方法，为传染性疾病的即时检测提供了广阔的应用前景。

图3. 光热检测体系用于对结核杆菌目标物的定量、特异性检测结果：（A）温度升高值随MTB的DNA浓度的变化；（a-b）不同DNA浓度的检测结果，（c）利用着色溶液的检测结果；（B）目标物和不同干扰物在检测体系的温度升高值。

这一研究成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者周婉，目前博士在读。

       原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Low-Cost Quantitative Photothermal Genetic Detection of Pathogens on a Paper Hybrid Device Using a Thermometer Wan Zhou, Jianjun Sun, XiuJun Li* Anal. Chem., 2020, 92, 14830-14837. DOI: 10.1021/acs.analchem.0c03700